脯an酸（PRO）含量測定試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

Pro 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，逆境條件下，植物體內Pro 含量顯著增加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯an酸。因此，脯an酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標之一。

測定原理：

用磺基水楊酸（SA）提取Pro，加熱處理后，Pro 與酸性茚三酮溶液反應生成紅色；加甲苯萃取后，在 520nm 測定吸光度。

脯an酸（PRO）含量測定試劑盒   抗逆系列

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、冰乙酸 25ml、甲苯 50ml、研缽、冰和蒸餾水。

樣品測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；之后置 95℃水浴振蕩提取 10min；10000g， 25℃離心 10min，取上清，冷卻后待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），勻漿；之后置 95℃水浴振蕩提取 10min；10000g，25℃離心 10min，取上清，冷卻后待測。

2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（ml）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議取 0.1ml 血清（漿）加入 1ml 提取液），充分混勻，之后置 95℃水浴振蕩提取 10 分鐘，10000g，25℃離心 10 分鐘，取上清，冷卻后待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 520nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定：

(1) 取0.25ml 樣本+0.25ml 試劑一+0.25ml 試劑二 于有蓋EP 管中，置 95℃水浴中保溫 30min（蓋緊，防止水分散失），每 10min 振蕩一次。

(2) 待冷卻后，加入 0.5ml 試劑三，振蕩 30s，靜置片刻，使色素轉至試劑三中；吸取 0.2ml 上層溶液于微量石英比色皿或 96 孔板中，于 520nm 波長處比色，記錄吸光值 A。

Pro 含量計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、典型回歸方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 為脯an酸含量，μg/ml；y 為吸光值A)

2、按照血清（漿）體積計算

Pro 含量(μg/ml)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro 含量(µg/g 鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

Pro 含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25ml；V2：加入提取液體積，1 ml；V3：加入血清（漿）體積，0.1 ml； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1、典型回歸方程 y = 0.02605x - 0.0021 (x 為脯an酸含量，μg/ml；y 為吸光值A)

2、按照血清（漿）體積計算

Pro 含量(μg/ml)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質量計算

Pro 含量(µg/g 鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W

3、按照細菌或細胞密度計算

Pro 含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25ml；V2：加入提取液體積，1 ml；V3：加入血清（漿）體積，0.1 ml； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

注意：zui低檢測限為 1μg/ml 或 1μg /g 鮮重 或 0.01μg /mg prot

脯an酸（PRO）含量測定試劑盒   抗逆系列