His-Tag蛋白純化磁珠常見問題與解決方案

　更新時間：2025-10-22　點擊量：68

　　在分子生物學與蛋白研究領域，His-Tag（組氨酸標簽）蛋白純化因特異性高、操作簡便的優勢被廣泛應用，而His-Tag 蛋白純化磁珠作為核心工具，更是憑借 “快速分離、低樣品損耗、適配微量樣品” 的特點，成為科研人員的較好選擇。

　　一、磁珠如何 “精準捕捉” His-Tag 蛋白？?

　　His-Tag 蛋白純化磁珠的核心是金屬螯合親和層析（IMAC）原理，通過磁珠表面固定的金屬離子與蛋白標簽的特異性結合，實現目標蛋白的分離純化，具體過程可分為 “結合 - 洗滌 - 洗脫” 三步：

　　1、磁珠表面的金屬離子螯合

　　磁珠基質（通常為超順磁性氧化鐵顆粒，外包聚苯乙烯或硅膠）表面修飾有螯合基團（如亞氨基二乙酸 IDA、 nitrilotriacetic acid NTA），這些基團能穩定結合二價金屬離子（常用 Ni²?、Co²?，其中 Ni²?親和力強、適用范圍廣，Co²?特異性更高、非特異性結合少）。

　　2、His-Tag 與金屬離子的配位結合?

　　目標蛋白的 His-Tag（通常由 6-10 個連續組氨酸組成）中，組氨酸的咪唑環能與磁珠表面的金屬離子形成配位鍵，使目標蛋白特異性吸附在磁珠表面；而雜蛋白因無 His-Tag 或親和力極弱，不會與磁珠結合，從而實現初步分離。

　　3、洗滌與洗脫的特異性調控?

　　- 洗滌階段：通過加入含低濃度咪唑（通常 20-50mM）的洗滌緩沖液，競爭性結合磁珠表面的金屬離子，洗脫非特異性吸附的雜蛋白，同時保留目標蛋白（目標蛋白與金屬離子的結合力更強，需更高濃度咪唑才能競爭）。

　　- 洗脫階段：提高緩沖液中咪唑濃度（通常 200-500mM），或調節 pH 值（如 pH 降至 4.0-5.0，破壞組氨酸咪唑環與金屬離子的配位鍵），使目標蛋白從磁珠表面解離，最終得到純化的 His-Tag 蛋白。
二、常見故障及解決方法

常見問題?	可能原因?	解決方案?
目標蛋白結合率低，上清液中仍有大量目標蛋白?	1、磁珠未充分活化，金屬離子脫落；	1、更換新磁珠，或用 0.1M NiSO?溶液重新螯合金屬離子；
	2、 His-Tag 被蛋白折疊掩蓋；	2、加入變性劑（如 8M 尿素）變性后純化，或更換更長的 His-Tag（如 10×His）；
	3、裂解緩沖液 pH 不當（非 7.0-8.0）?	3、調整緩沖液 pH 至 7.4-7.6?
洗脫液中雜蛋白多，純度低?	1、洗滌緩沖液咪唑濃度過低；	1、逐步提升咪唑濃度至 50-80mM，增加洗滌次數；
	2、雜蛋白非特異性結合磁珠基質；?	2、洗滌緩沖液中加入 0.1% Tween-20，減少非特異性結合；
	3、磁珠用量過多，吸附過量雜蛋白	3、減少磁珠用量（如 50μL 對應 0.5mg 目標蛋白）?
洗脫后蛋白變性、聚集，SDS-PAGE 出現 smear 帶?	1、洗脫溫度過高（>25℃）；	1、全程 4℃操作，洗脫時冰浴；?
	2、洗脫緩沖液無保護劑；?	2、洗脫緩沖液中加入 10% 甘油或 0.5mM DTT，保護蛋白結構；
	3、咪唑濃度過高（>500mM）	3、降低咪唑濃度至 200-300mM，延長洗脫時間至 10 分鐘
磁珠吸附效率下降，重復使用后結合力變弱?	1、再生不完整，殘留蛋白或咪唑；	1、增加再生緩沖液孵育時間至 10 分鐘，多洗 1 次去離子水；
	2、金屬離子流失；	2、每次再生后用 0.1M NiSO?重新螯合金屬離子；
	3、磁珠破碎，表面積減少?	3、振蕩時避免劇烈，棄用破碎的磁珠?

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