His-Tag（組氨酸標(biāo)簽）是一種廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)和純化的技術(shù)。通過(guò)在目標(biāo)蛋白的N端或C端添加6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基（HHHHHH），可以利用金屬離子（如鎳或鈷）的親和作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的高效純化。His-Tag蛋白純化磁珠因其高效、便捷和高特異性，成為實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中的常用工具。 一、工作原理
His-Tag蛋白純化磁珠基于金屬離子親和層析（IMAC）原理。磁珠表面的配體（如NTA-Ni²?或IDA-Ni²?）與His-Tag中的組氨酸殘基具有高度親和力。在適當(dāng)?shù)木彌_液條件下，His-Tag蛋白與磁珠結(jié)合，而其他雜質(zhì)則被洗脫。通過(guò)調(diào)整緩沖液中的咪唑濃度，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的特異性洗脫。
二、純化步驟
1、準(zhǔn)備樣品
?。?）裂解細(xì)胞：根據(jù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，選擇合適的裂解方法。例如，細(xì)菌細(xì)胞可以通過(guò)超聲波裂解，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以通過(guò)溫和的裂解緩沖液處理。
?。?）去除雜質(zhì)：通過(guò)離心或過(guò)濾去除細(xì)胞碎片和其他大顆粒雜質(zhì)。
2、磁珠準(zhǔn)備
?。?）重懸磁珠：輕輕吹打磁珠，使其均勻懸浮。
?。?）洗滌磁珠：用平衡緩沖液（如20 mM Tris-HCl, pH 7.4）洗滌磁珠，去除保存液。
3、結(jié)合
?。?）混合樣品和磁珠：將裂解后的樣品與磁珠混合，輕輕攪拌以促進(jìn)結(jié)合。
?。?）孵育：在適當(dāng)?shù)臏囟龋ㄍǔ?°C）下孵育30分鐘至1小時(shí)。
4、洗滌
?。?）去除未結(jié)合蛋白：使用磁力架分離磁珠，去除上清液。
?。?）洗滌磁珠：用洗滌緩沖液（如20 mM Tris-HCl, 30 mM咪唑, pH 7.4）洗滌磁珠，重復(fù)3-5次。
5、洗脫
?。?）洗脫目標(biāo)蛋白：用洗脫緩沖液（如20 mM Tris-HCl, 500 mM咪唑, pH 7.4）洗脫目標(biāo)蛋白。
?。?）收集洗脫液：將洗脫液收集于新的離心管中。
三、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1、高特異性：His-Tag與磁珠表面的金屬離子具有高度特異性結(jié)合，可有效去除雜質(zhì)。
2、高載量：每毫升磁珠可結(jié)合超過(guò)20 mg的His-Tag融合蛋白。
3、快速便捷：整個(gè)純化過(guò)程可在1小時(shí)內(nèi)完成，無(wú)需復(fù)雜的柱層析操作。
4、兼容性強(qiáng)：適用于多種表達(dá)系統(tǒng)和蛋白類型，包括N端和C端His-Tag蛋白。
四、注意事項(xiàng)
1、緩沖液選擇：避免使用含有EDTA、EGTA等螯合劑的緩沖液，以免影響磁珠性能。
2、咪唑濃度：根據(jù)目標(biāo)蛋白的特性，優(yōu)化咪唑濃度以提高純化效率。
3、磁珠保存：使用后應(yīng)立即用保護(hù)液重懸并保存于2-8°C。
His-Tag蛋白純化磁珠是一種高效、便捷的純化工具，適用于多種實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)應(yīng)用場(chǎng)景。通過(guò)優(yōu)化純化步驟和條件，可以實(shí)現(xiàn)高純度、高得率的目標(biāo)蛋白純化。
