堿性磷酸酶（AKP/ALP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/48S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

AKP/ALP 是一種含鋅的糖蛋白酶，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化合物。

AKP/ALP 廣泛分布于人體各臟器中，以肝臟為主。

測(cè)定原理：

在堿性環(huán)境中，AKP/ALP 催化磷酸苯二鈉生成游離酚；酚與 4-氨基安替bi林和鐵氰hua鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物，在 510nm 有特征光吸收；通過(guò)測(cè)定 510 nm 吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算AKP 活性。

堿性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒 酯酶系列

組成：

試劑四：液體×1 瓶，4℃避光保存，未變成藍(lán)綠色之前均可使用。標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 支（EP 管中），2 μmol/ml 酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，4℃、8000g 離心 10min，取上清液待測(cè)。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血液可直接測(cè)定，或者適當(dāng)稀釋后測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 510 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3. 空白管：取EP 管，加入 4μl 蒸餾水，40μl 試劑二，40μl 試劑三，混勻后置于 37℃水浴中保溫 15min；加入試劑四 120μl，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為A 空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP 管，加入 4μl 標(biāo)準(zhǔn)品，40μl 試劑二，40μl 試劑三，混勻后置于 37℃水浴中保溫 15min；

加入試劑四 120μl，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 對(duì)照管：取EP 管，加入 4μl 上清液，40μl 蒸餾水，40μl 試劑三，混勻后置于 37℃水浴中保溫 15min；加入試劑四 120μl，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為A 測(cè)定管。

6. 測(cè)定管：取EP 管，加入 4μl 上清液，40μl 試劑二，40μl 試劑三，混勻后置于 37℃水浴中保溫 15min；

加入試劑四 120μl，混勻后于 510nm 測(cè)定吸光度，記為A 測(cè)定管。其中標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做一管，測(cè)定管和對(duì)照管每個(gè)樣均需做。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

AKP/ALP 活性計(jì)算：

1. 血液中AKP/ALP 活力計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 酚定義為 1 個(gè)酶活單位。

AKP/ALP 活力(μmol/min /ml)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總] ÷V 樣

÷T=6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

2. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中AKP/ALP 活性計(jì)算

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個(gè)酶活單位。 AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]÷(Cpr×V樣)÷T=6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個(gè)酶活單位。

AKP/ALP(μmol/min/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]÷(W×V 樣÷V樣總)÷T=6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

（3） 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個(gè)酶活單位。AKP/ALP (μmol/min/10⁴ cell)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T= 6.8×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)品：2μmol/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積（ml），205μl=0.205ml； Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定，建議使用本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（ml），0.004ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min），15 min。

注意事項(xiàng)：

1. 試劑二、試劑三和試劑四均需避光保存。

2. 試劑四變藍(lán)綠色后不能再使用。

3. 加入試劑四后必須立即混勻，否則顯色不wan全。

堿性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒 酯酶系列