γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

γ-GT 是γ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化GSH 降解。γ-GT 催化GSH 或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移到受體。也可以催化 GSH 和其他γ-谷氨?；衔锏乃?，產(chǎn)生谷an酸鹽，在細(xì)胞外谷胱gan肽新陳代謝中起了重要的作用。

測(cè)定原理：

γ-GT 催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺中γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移給 N-甘an酰甘an酸，生成對(duì)硝基苯胺，在 405nm 有特征光吸收；通過測(cè)定 405nm 光吸收增加速率，來計(jì)算γ-GT 酶活性。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）試劑盒 谷胱gan肽

組成：

工作液（在試劑二瓶中配制）：臨用前配制，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解（室溫過低時(shí)可以40℃水浴促進(jìn)溶解）；然后把試劑四倒入試劑二瓶中，混勻后室溫保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸餾水

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

γ-GT 測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 405 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱 30min（保證無沉淀）。

3. 測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，依次加入 20μl 上清液，180μl 工作液，混勻后于 405nm 測(cè)定 10s和 70s 時(shí)吸光度，記為 A1 和A2。

γ-GT 活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006x+0.0016，x 為對(duì)硝基苯胺濃度，y 為吸光值，R²=0.999。

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/ml）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反總÷V 樣÷T

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016]

V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μl=2×10^-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/ml）；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（ml），20μl=0.02 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1min。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.003x+0.0016，x 為對(duì)硝基苯胺濃度，y 為吸光值，R²=0.999。

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=3.34× [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 對(duì)硝基苯胺為 1 個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/ml）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V 反總÷V 樣÷T

= 3.34 × [ (A2－A1)－0.0016]

V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μl=2×10^-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/ml）；W ：樣品質(zhì)量，g；V 樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（ml），20μl=0.02 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間（min）， 1min。

注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)細(xì)胞中γ-GT 活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中γ-GT 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞（防止因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性導(dǎo)致酶失活）。

2. 配置好的工作液 2 周內(nèi)使用完畢。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）試劑盒 谷胱gan肽