莽草酸脫氫酶（Shikimate dehydrogenase，SD）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

莽草酸途徑是存在于植物、真菌和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶是莽草酸合成途徑中的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

莽草酸脫氫酶催化莽草酸和 NADP 產(chǎn)生NADPH，檢測(cè) 340nm 下的吸光值增加速率來(lái)表示 SD 活性。

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試劑組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

粗酶液提取：

1、 血清（漿）中 NADP⁺和NADPH 的提取

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）

為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

在試劑二中加入 25ml 試劑一充分溶解混勻，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（1） 取 0.05ml 樣本和 0.95ml 試劑二于 1ml 比色皿中，混勻，在 340 nm 波長(zhǎng)下立即記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度A1 和 5 分 20 秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

SD 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SD（nmol /min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V×樣Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SD（nmol /min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SD（nmol /min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.286×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

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