一步法無縫克隆試劑盒不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用重疊片段重組的方法，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有16-25bp重疊區域的PCR片段定向重組連接
One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆

One Step Seamless Cloning Kit (單片段)

One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆

目錄號：42111

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產品儲存：-20°C保存，避免多次反復凍融

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

制品說明：一步法無縫克隆試劑盒不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用重疊片段重組的方法，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有16-25bp重疊區域的PCR片段定向重組連接，可以30分鐘內實現A末端或者平末端PCR產物片段高效定向無縫克隆至載體的任意位點。

產品特點：

1.  30分鐘可以將一個50bp-15kb PCR擴增片段（平/A末端）克隆插入任意載體的任意位置。

2.不受載體和插入片段酶切位點的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位點進行克隆。

3.  無縫克隆，插入點不會引入不需要的堿基序列。

4.  不依賴于連接酶及磷酸酶，高效，準確，克隆陽性率可達95%以上。

一步法無縫克隆試劑盒原理示意圖：

線性化載體和插入DNA片段的制備：

A：線性化載體的制備

(1). 酶切來源：酶切所得線性載體，平末端或者粘端、單酶切或者雙酶切均可，酶切后膠回收。

注： 一步法無縫克隆反應體系內無雙鏈DNA連接酶，不會發生載體自連反應。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進行末端脫磷酸處理。重組產物轉化后出現的假陽性克隆 (無插入片段) 是由酶切不wan全未線性化環狀載體轉化而形成的。我們推薦酶切后膠回收可以把這種未線性化載體比例降低到zui低程度。

(2). 反向PCR來源：建議使用高保真DNA聚合酶（貨號：P517-05或者P812-05）制備，如果擴增條帶單一可以通過PCR產物純化（貨號：DC012-50）獲得載體，否則通過膠回收（貨號：DC011-50)獲得載體。

注：反向PCR的質粒模板也是非線性化載體，也可能導致假陽性克隆（無插入片段），因此PCR來源線性載體（PCR產物）純化前用Dpn I內切酶消化質粒模板，可以降低背景，提高陽性率。但是一般情況下，經過膠回收已經足以把這種未線性化載體比例降低到zui低，因此反向PCR來源的線性化載體我們也推薦膠回收。

B：插入DNA片段的制備

(1). 一步法無縫克隆引物設計總的原則是：通過在引物5’ 端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴增產物5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的wan全一致的序列 (16 bp～20 bp)。

(2). 插入片段引物設計：克隆引物包括插入片段特異性引物序列和重疊序列。

克隆正向引物(5’-3’)：線性載體正向16-25 nt重疊區序列(3’末端算起)+插入片段正向特異引物序列（18-25 nt）

克隆反向引物(5’-3’)：線性載體反向16-25 nt重疊區序列(3’末端算起)+插入片段反向特異引物序列（18-25 nt）

注意：重疊區的堿基數至少16 bp，并且多段重疊區域之間的Tm值需保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)，否則可延長堿基數目直到符合要求。

按照線性載體末端的結構（5’突出，3’突出，平末端），引物設計也分3種情況，示意如下：

線性化載體的兩端因線性方式（如單酶切、雙酶切、反向PCR）不同，可以是以上三種末端結構的兩兩任意組合，插入片段特異性引物設計的原則遵循一般引物設計的原則即可。

計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算。

(3). 酶的選擇：建議使用高保真DNA聚合酶或者PCR Mix（貨號：P517-05或者P814-05）。

(4). 反應條件：一般按照具體使用的聚合酶說明書進行即可。

(5). 純化插入片段

l   可選：如果片段來源于質粒模板，且該質粒與重組載體具有相同抗性，純化前用Dpn I內切酶消化質粒模板， 可降低背景，提高陽性率。

l   如果片段單一，則建議用PCR產物純化試劑盒（貨號：DC012-100）純化片段。

l   如果有非特異擴增，則建議用膠回收試劑盒（貨號：DC011-100)回收片段。

l   使用該方法克隆，用來線性化載體的酶切位點在拼接的時候會缺失，如果對酶切位點有嚴格要求的，建議注意酶切位點的選擇，必要時可在正反向克隆引物的重疊區序列和特異基因序列之間增加缺失掉的堿基來恢復原有酶切位點（見后面舉例說明）。

l   如果重組質粒用于蛋白表達，則在引物設計時注意讀碼框，蛋白表達及純化所需序列（如啟動子，RBS序列，起始密碼子，終止密碼子，蛋白標簽等）不被破壞。

正向引物設計舉例說明（EcoR I 酶切開）：

如上圖，載體由Ecor I 酶切開，形成5’突出末端：

根據上述設計原則，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列），加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

正向引物具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設計完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點將會消失（不保留酶切位點）。

如果需要保留 EcoR I 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的EcoR I 識別位點序列aattc，完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點依然存在（保留酶切位點）。

具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

反向引物設計舉例說明（Hind III 酶切開）：                           

如上圖，載體由Hind III 酶切開，形成5’突出末端：

根據上述設計原則，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列），加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

反向引物具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設計完成克隆連接后，Hind III 切位點將會消失（不保留酶切位點）。

如果需要保留 Hind III 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的Hind III 識別位點序列agctt ，Hind III 酶切位點依然存在（保留酶切位點）。

具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

無縫克隆反應的操作步驟：

注意：2 × OneStep Cloning Mix 含有連接增強劑PEG很粘稠，從冰箱拿出來溫度低時更粘稠，可以放在手心化凍幾分鐘提高溫度便可降低粘稠度（不影響質量），輕彈混勻，瞬間離心收集到管底。

1.   按照下表建立反應體系（可使用PCR管在室溫配制）

* 載體一般用20-50 ng，插入片段與載體的摩爾比在2:1-3:1之間最佳；如果插入片段小于200bp，插入片段與載體的摩爾比用5:1 。

2.      輕輕混勻，在50°C反應15分鐘（可在PCR儀器上進行），反應結束后，將PCR管置冰上后直接轉化或者保存于-20°C。較短片段例如100bp-1kb只需要15分鐘便能獲得足夠轉化子，較長片段的連接，可以延長反應時間到60分鐘。

3.     取5μl 反應產物按照感受態細胞說明書進行轉化（如果轉化子較少，可以將所有的產物轉化并將所有的轉化液涂板）。

陽性克隆的鑒定：

可根據具體情況，選擇菌落PCR鑒定，提取質粒（貨號31013-100）進行限制性內切酶鑒定或測序鑒定。

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