腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測定試劑盒

（ 微量法 100T/96S）

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP 反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測定原理：

AGP 催化的逆向反應(yīng)生成 G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下測定NADPH 增加速率，即可計算AGP 活性。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性試劑盒淀粉

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 9mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 4mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

粗酶液制備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置 30℃保溫 10min 以上。

3、在EP 管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫 15 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻后，4000g4℃離心 5min，取上清液，在 96 孔板中依次加入下列試劑

混勻后，立即于 340 nm 波長下記錄初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

AGP 活性計算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活性單位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

=2813×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活性單位。

AGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

=5627×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)

=5627×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。

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