葉綠體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

葉綠體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP 合酶。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化 ATP 合成，也可逆過(guò)程水解ATP。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP 的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

復(fù)合體Ⅴ水解ATP 產(chǎn)生ADP 和Pi，通過(guò)測(cè)定Pi 增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。

葉綠體復(fù)合體Ⅴ試劑盒   氧化磷酸化系列

試劑的組成和配制：

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 2ml 蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 4ml 蒸餾水，充分混勻；溶解后 4℃保存一周；

試劑五：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分混勻；溶解后 4℃保存一周；試劑六：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分混勻；溶解后 4℃保存一周；

定磷試劑的配制：按H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

葉綠體的提取：

1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1ml 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿，很快研磨或搗碎，30 秒內(nèi)完成，使之成為勻漿液。

2、將勻漿液于 200g（離心率），4℃離心 1min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，1500g，4℃離心 5min。

4、棄上清液，于沉淀中加入 0.5ml 試劑一混勻配成葉綠體懸浮液。混勻后測(cè)定葉綠體酶活性。

測(cè)定步驟：

1、酶促反應(yīng)（在EP 管中加入下列試劑）

混勻， 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 30min：

混勻，4000g，25℃離心 10min，取上清液

2、定磷(在EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫靜置 10min 后，在 660nm 處讀取A 測(cè)定管和A 對(duì)照管，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y 為A 值。

1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T =62.8× (ΔA-0.004)÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10-4 L； V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，

0.5 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 0.637x + 0.004；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y 為A 值。

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=125.6× (ΔA-0.004)÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反總×106]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=62.74× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.126× (ΔA-0.004)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10-4 L； V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，

0.5 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

葉綠體復(fù)合體Ⅴ試劑盒   氧化磷酸化系列