許多高溫DNA聚合mei，如Taq DNA聚合mei、Tth DNA聚合mei等擴增的PCR產(chǎn)物在3’-末端后都帶有一個突出的堿基A，這樣的PCR產(chǎn)物可以用3’-末端后帶有一個突出堿基T的載體方便地進行克隆。
pBLUE -T 載體克隆試劑盒 T4原理載體

pBLUE -T 載體克隆試劑盒

pBLUE -T 載體克隆試劑盒   T4原理載體

目錄號：42014

試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：

－20℃儲存，6個月內(nèi)不影響使用效果。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

產(chǎn)品介紹：

許多高溫DNA聚合mei，如Taq DNA聚合mei、Tth DNA聚合mei等擴增的PCR產(chǎn)物在3’-末端后都帶有一個突出的堿基A，這樣的PCR產(chǎn)物可以用3’-末端后帶有一個突出堿基T的載體方便地進行克隆。pBLUE-T 載體來源于pBlueScript II SK(+) 質(zhì)粒，在EcoRImei切位點處添加了適當(dāng)序列，經(jīng)XCM I mei切后其3’末端直接產(chǎn)生未配對的T堿基而成，因此有更高的重組效率。pBLUE-T 載體插入位點兩端du特設(shè)計的兩個ECOR I位點使插入片段可以用廉價高效的ECOR I單mei切檢測； 同時pBLUE-T 載體不含NdeI或NcoI限制性內(nèi)切mei位點，可方便用于克隆含上述mei切位點的基因。此外，本公司載體連接體系還有背景低（藍斑小于10%），重組率高（白斑中超過90%有插入片段），可快速連接等特點。本說明書末列出了pBLUE-T 載體相關(guān)的技術(shù)資料，其全序列可參照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆mei切位點處序列稍有不同。

測序可以采用T3、T7啟動子引物和M13通用測序引物（見后面圖譜）

操作步驟：

1.    連接反應(yīng)的準備：

PCR產(chǎn)物是否要進行純化取決于擴增產(chǎn)物的質(zhì)量。如果PCR產(chǎn)物非常干凈，不經(jīng)純化就可直接進行連接反應(yīng)。但如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則必須進行純化，模板質(zhì)粒有可能也形成白斑。PCR產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收。

Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合mei擴增的PCR產(chǎn)物，其末端都帶有一個突出的3’ -A。 具有3’ -A末端的PCR產(chǎn)物可以直接用pBLUE-T 載體進行克隆連接。具有3’®5’外切mei活性的DNA聚合mei（高保真mei）擴增的PCR產(chǎn)物是平末端，要對這種平末端PCR產(chǎn)物進行克隆，應(yīng)先進行3’--端加A工作。

2.    常規(guī)連接反應(yīng)：

1)   在一個標(biāo)準的10 ml連接反應(yīng)體系中，加入1 ml 30ng pBLUE-T 載體、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產(chǎn)物進行精確定量，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1就可以得到良好結(jié)果，推薦3:1)、1ml 10′ligation Buffer和0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase，其余用水補足。反應(yīng)按以下體系進行：

1ml                   10′Ligation Buffer (用前充分融解混勻)

1ml                    10 ′ PEG Enhancer

1ml                   pBLUE-T Vector

Xml                   純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control

Yml                   無菌水

0.5-1ml (5 Weiss Units/ml)  T4 DNA Ligase

Final Volume    10ml

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)   16℃連接過夜（一般可在PCR儀器完成）。

通常推薦16℃連接過夜（10ml體系標(biāo)準連接mei量為2.5 Weiss Units即可），可以得到最多的轉(zhuǎn)化子。但是本系統(tǒng)含PEG Enhancer可以提高連接效率數(shù)倍，在高連接mei量的情況下（10ml體系推薦連接mei量為5 Weiss Units）16℃連接30分鐘即可達一般研究的要求。

3)   冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。

3.    快速連接反應(yīng)：

1)   反應(yīng)按以下體系進行：

5ml                   2 ′ Quick Ligation Buffer (用前充分融解混勻)

1ml                   pBLUE-T  Vector

Xml                   純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control

Yml                   無菌水

1ml (5 Weiss Units/ml)      T4 DNA Ligase

Final Volume    10ml

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2)   22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。

2 ′Quick Ligation Buffer已經(jīng)包含所有優(yōu)化的快速連接成份，通常推薦22℃連接10分鐘（10ml體系連接mei量為5 Weiss Units，長片段連接可以延長至30分鐘）一般可以得到滿意結(jié)果。此外本系統(tǒng)也可在16℃連接30分鐘（10ml體系連接mei量為5 Weiss Units）即可達一般研究的要求。

3)   冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。

4.    轉(zhuǎn)化：

e  50-100ml感受態(tài)細胞，置于冰上，wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。

e  加入4－5ml連接液(最多可全部加入，只要體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。

e  加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘。

e  將200ml細菌涂布在預(yù)先用16ml 50mg/ml IPTG和40ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐青mei素平板上。

涂布細菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細胞的感受率而進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如果 預(yù)計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少，可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。

e  平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。

5     篩選：

1).  轉(zhuǎn)化子的藍白篩選：

當(dāng)外源DNA片段插入到pBLUE-T 中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物b-半乳糖苷meia-片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍色。有的時候插入片段沒有影響lacZ 基因讀碼框， 或插入片段太小，這種情況下菌落（重組克隆）呈現(xiàn)淡藍色或者在菌落中心呈現(xiàn)淡藍斑點，外圈白色（魚眼狀藍斑fish eye）。選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落或者淡藍色菌落，用牙簽挑至含氨芐青mei素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。

2).  轉(zhuǎn)化子的鑒定：

a.     用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，用ECOR I 單mei切或用其它合適的mei切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段。

b.     挑取白色菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者咨詢我們）

c.     用T3和T7啟動子引物或其它合適的引物測序來確定是否含有目的克隆。

一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：

[加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）÷載體大小（kb）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng，插入片段大小為1000bp，這時應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體×1kb插入片段÷2.984kb載體]×3/1=40.2ng。

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